Evaluación preclínica del SARS fabricable

Medicina de las Comunicaciones volumen 3, Número de artículo: 116 (2023) Citar este artículo

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A medida que la pandemia de COVID-19 continúa evolucionando, es necesario desarrollar nuevas vacunas que sean fácilmente fabricables y proporcionen eficacia clínica contra las variantes emergentes del SARS-CoV-2. Las partículas similares a virus (VLP) que presentan el antígeno de pico en su superficie ofrecen beneficios notables sobre otros formatos de antígenos de vacunas; sin embargo, las vacunas candidatas actuales contra el SARS-CoV-2 VLP en desarrollo clínico enfrentan desafíos que incluyen una baja productividad volumétrica, una densidad deficiente del antígeno de pico, una glicosilación de proteínas divergente impulsada por la plataforma de expresión y complejos requisitos de procesamiento ascendentes y descendentes. A pesar de su amplio uso para la fabricación de proteínas terapéuticas y su capacidad comprobada para producir VLP envueltas, las células de ovario de hámster chino (CHO) rara vez se utilizan para la producción comercial de vacunas basadas en VLP.

Utilizando células CHO, nuestro objetivo era producir VLP que mostraran el pico de longitud completa del SARS-CoV-2. Se utilizó cromatografía de afinidad para capturar las VLP liberadas en el medio de cultivo a partir de células CHO modificadas genéticamente que expresan pico. La estructura, el contenido de proteínas y la glicosilación de las espigas en las VLP se caracterizaron mediante varios métodos bioquímicos y biofísicos. In vivo, se probó la generación de anticuerpos neutralizantes y la protección contra la infección por SARS-CoV-2 en modelos de ratón y hámster.

Demostramos que la sobreexpresión de picos en células CHO es suficiente por sí sola para generar títulos altos de VLP. Estas VLP evocan el virus nativo pero con una densidad de picos al menos tres veces mayor. In vivo, las VLP purificadas provocan una fuerte inmunidad humoral y celular a niveles de dosis de nanogramos que otorgan protección contra la infección por SARS-CoV-2.

Nuestros resultados muestran que las células CHO son susceptibles de fabricar eficientemente títulos elevados de un antígeno de vacuna VLP basado en proteína de pico potentemente inmunogénico.

Las partículas similares a virus (VLP) tienen una estructura similar a la de los virus, pero no pueden causar infecciones ni enfermedades. Si se inyectan VLP en el cuerpo, producen una respuesta inmune similar a la que se observa después de una infección por un virus. Esto significa que las VLP pueden usarse como vacunas contra virus que causan enfermedades en las personas. Muchos medicamentos, denominados productos biológicos, se fabrican utilizando células vivas, incluidas células que originalmente se derivaron de los ovarios de hámster chino (células CHO). Desarrollamos un método simple para producir VLP similares al virus SARS-CoV-2 en células CHO. Mostramos que la vacunación de roedores con estas VLP evita que enfermen tras la infección por SARS-CoV-2. Estas VLP podrían formar parte de una vacuna alternativa de fácil producción para la prevención de la COVID-19 en humanos.

En la búsqueda de vacunas seguras, económicas y eficaces contra el coronavirus 2 (SARS-CoV-2), de la neumonía asiática, se ha explorado una serie de estrategias de producción y administración de antígenos. En EE. UU. y Canadá, las primeras vacunas aprobadas se basaron en la expresión del antígeno pico (S) inducida por ARNm o vector adenoviral por parte de las células huésped1. Las vacunas antigénicas purificadas y con adyuvante, que pueden consistir en proteínas S (completas o fragmentadas) como Nuvaxovid (Novavax) y VidPrevtyn (Sanofi/GSK), o VLP decoradas con S como Covifenz (Medicago), se desarrollaron más lentamente pero han ganó prominencia con aprobaciones recientes por parte de las autoridades reguladoras. En este sentido, se ha demostrado que Novavax NVX-COV2373, que contiene la secuencia S ancestral, después de tres dosis genera títulos medios geométricos (GMT) más sólidos de anticuerpos neutralizantes contra el sublinaje Omicron BA.1 que la vacuna de ARNm BNT162b2. De manera similar, en comparación con el Comirnaty original (Pfizer BioNTech), se demostró que las dosis de refuerzo de VidPrevtyn en diferentes ensayos clínicos restablecen la inmunidad contra diferentes variantes del SARS-CoV-2 con mayor actividad neutralizante contra Omicron BA.13. Las VLP que muestran proteína S recuerdan estructuralmente a los virus de tipo salvaje4, lo que promueve una alta inmunogenicidad debido a su conjunto repetitivo de antígenos que induce fuertes respuestas Th1/Th2. Las ventajas adicionales de las VLP como antígenos de vacunas incluyen estabilidad en el almacenamiento, fuerte reconocimiento y absorción por parte de las células presentadoras de antígenos (APC) periféricas; Las VLP también eliminan el riesgo de cepas revertidas y la posible pérdida de epítopos neutralizantes clave asociados con virus atenuados e inactivados5,6,7,8.

Las VLP que muestran antígenos S están cada vez más consideradas como candidatas para el desarrollo clínico de una vacuna contra el SARS-CoV-2. Las vacunas VBI han completado los ensayos de fase I de una vacuna basada en VLP basadas en la proteína central retroviral Gag coexpresada con la proteína S9, un enfoque común para inducir la formación de VLP en células de mamíferos. Medicago (Covifenz) obtuvo la aprobación regulatoria en Canadá para las VLP producidas en plantas de N. benthamiana mediante la expresión de una construcción quimérica que consiste en el ectodominio S fusionado a los dominios transmembrana y C-terminal de la influenza HA10,11. Las VLP también se pueden producir mediante la coexpresión de las proteínas estructurales de la membrana (M), la envoltura (E), la nucleocápside (N) y S del coronavirus, un enfoque que da como resultado que las VLP se parezcan más al virión natural y que también se encuentra en fase de experimentación clínica. evaluación4,12.

La promesa de las VLP como antígenos de la vacuna contra el SARS-CoV-2 se ve contrarrestada por problemas comunes que incluyen desafíos de fabricación, rendimientos deficientes de partículas, baja densidad de proteína S en las partículas y glicosilación no similar a la humana impulsada por plataformas de expresión heteróloga. Por estas razones, y debido a nuestro éxito en la expresión de la proteína S en niveles muy altos en células de ovario de hámster chino (CHO)13,14,15, exploramos si estas células, el huésped predominante de células de mamíferos para la fabricación de proteínas terapéuticas, también podrían ser utilizado para producir eficazmente VLP del SARS-CoV-2.

Aquí, describimos cómo la expresión de la proteína S nativa de longitud completa del SARS-CoV-2 en células CHO induce la liberación de abundantes VLP recubiertas con S (S-VLP) sin requerir la coexpresión de ninguna proteína estructural viral adicional. Estas S-VLP se pueden producir en células CHO diseñadas para la producción anulada de partículas endógenas similares a retrovirus (ERVLP), que de otro modo podrían contaminar la vacuna candidata. Se logró una purificación eficaz de S-VLP a partir de sobrenadantes de cultivos celulares utilizando un protocolo de cromatografía de afinidad de un solo paso. Se realizaron diversos ensayos bioquímicos y biofísicos para caracterizar estas partículas en detalle, incluida la concentración de proteína S, el tamaño de partícula, la densidad de la superficie de S y la identidad de N-glicanos. Finalmente, demostramos que las S-VLP purificadas son muy potentes como antígenos de vacunas en modelos preclínicos de roedores y brindan una protección eficaz a niveles de dosis inferiores a microgramos con adyuvantes autorizados. Creemos que sus buenas características de capacidad de fabricación, estabilidad y eficacia hacen que estas VLP sean antígenos prometedores para las vacunas COVID-19 de próxima generación.

Las líneas celulares NRC CHO2353™ se han descrito previamente16,17. CHO2353 es un clon derivado de células CHO-DXB11 que se seleccionaron en función de sus altos rendimientos de producción de proteínas recombinantes. Se puede consultar una descripción completa del origen y selección de este clon en la ref. 15. El clon CHO-C2 se derivó del CHO2353 parental dirigiéndose e interrumpiendo las secuencias retrovirales gag y env responsables de la formación y liberación de ERVLP utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 de manera similar a la descrita en la ref. 18. Las células se mantuvieron en una formulación de medio patentada en matraces Erlenmeyer de policarbonato con tapa de ventilación de 0,2 µm (Corning) con agitación orbital constante a 120 rpm en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 a 37 °C. Todas las células utilizadas en este estudio fueron negativas para Mycoplasma.

Las secuencias codificantes del SARS-CoV-2 S, M y E se obtuvieron de la secuencia ancestral del genoma NC_045512. Todas las secuencias de proteína S contenían mutaciones en el sitio de escisión de furina (R682G, R683G, R685S), prolinas estabilizadoras (K986P, V987P) y etiqueta de epítopo HA C-terminal (YPYDVPDYA). Las construcciones de expresión para picos se prepararon resintetizando y reemplazando fragmentos de restricción que abarcan mutaciones presentes en Beta B.1.351 (L18F D80A, D215G, L241del, L242del, A243del, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V), Delta B. 1.617.2 (T19R, G142D, E156del, F157del, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N) y Omicron B.1.1.529 (A67V, H69del, V70del, T95I, G142D, V143del, Y144del, Y1 45del, N211del, L212I, E215del, E216del, E217del, F339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D6 14G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F) variantes. La construcción SmT2v3 consiste en el ectodominio de la cepa ancestral S del SARS-CoV-2 fusionada al pliegue T4 y es idéntica a la construcción ECDm-T4-Fib descrita anteriormente13 pero sin etiquetas de epítopo C-terminal. Todas las secuencias de genes se sintetizaron mediante GenScript, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU., y se subclonaron en el plásmido pTT5® entre los sitios de restricción EcoRI y BamHI. Los plásmidos se transformaron en bacterias E. coli DH5α (Invitrogen) y se amplificaron en medio CircleGrow (MP Biomedicals) suplementado con 100 µg/ml de ampicilina (Gibco). Los plásmidos se purificaron utilizando un método patentado de cromatografía de intercambio aniónico seguido de precipitación con isopropanol, lavado con etanol y filtración de 0,22 µm. La cuantificación del ADN se llevó a cabo utilizando un espectrofotómetro DeNovix DS-11+. Las secuencias se verificaron mediante secuenciación Sanger utilizando un analizador genético ABI 3500xl.

Los métodos de transfección de células CHO se realizaron como se describe en la ref. 13. Se realizaron transfecciones del gen estructural individual del SARS-CoV-2 en medio CHO con 85 % (p:p) de pTT5-Spike-HA, 10 % de plásmido Bcl-XL (efector antiapoptótico) y 5 % de plásmido GFP. La cotransfección de genes estructurales del SARS-CoV-2 se realizó utilizando una mezcla de plásmidos que comprende 42,5 % de envoltura de membrana (ME) de pTT5, 42,5 % de pTT5-Spike-HA, 10 % de Bcl-XL y 5 % de GFP diluidos en CHO. medios completos.

Cinco días después de la transfección, las suspensiones celulares (viabilidad ≥95%) se centrifugaron durante 15 minutos a 3200 rpm en una centrífuga Sorvall legend RT (Thermo Fisher Scientific). Luego, los sobrenadantes celulares se trataron con 10 U/ml de Denarase (C-LEcta), 5 mM de MgCl2 y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Para la sedimentación de VLP, los sobrenadantes tratados se centrifugaron sobre un cojín Optiprep al 15% (p/v) (Sigma-Aldrich)19 (10% del volumen total) a 5300 x g durante 16 h a 4 °C. Después de la centrifugación, se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en DPBS (Cytiva).

Los sobrenadantes de CHO-C2 tratados con denarasa se purificaron directamente en resina AVIPure-COV2S VLP (AVIpure) (Avitide) empaquetada en una columna de cromatografía BioRad PolyPrep. La columna AVIpure se equilibró primero con 5 volúmenes de columna (CV) de DPBS. A continuación, el sobrenadante tratado se cargó a un caudal constante de 1 ml/min. Luego se lavó la columna con 5 CV de DPBS. La VLP se eluyó con Bis-Tris 50 mM, MgCl2 1 M, pH 6,0, seguido de desalinización en DPBS utilizando columnas NAP25. Las VLP desaladas se esterilizaron con filtro y se analizaron para detectar endotoxinas (cartuchos Endosafe-PTS, Charles River) antes de los experimentos in vivo. El ectodominio S soluble SmT2v3 se produjo a partir de células CHO estables como se describió anteriormente y se purificó usando la resina NGL COVID-19 S Affinity (Repligen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las VLP sedimentadas o purificadas se lisaron con tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa (completo, sin EDTA, Roche ). Las muestras de VLP en tampón RIPA se incubaron a 4 °C durante 20 minutos, seguido de una centrifugación de 15 minutos a máxima velocidad en una centrífuga de mesa (Eppendorf 5427R). Se descartaron los pellets y se recuperaron los sobrenadantes. La cuantificación de proteínas se realizó con el ensayo de proteínas del ácido bicinconínico (BCA) de Pierce (Thermo Fisher Scientific). En resumen, se agregaron 200 µl de reactivo de trabajo BCA preparado según el protocolo del fabricante a una placa de 96 pocillos y se mezclaron con 25 µl de estándares de albúmina sérica bovina (BSA) (Thermo Fischer Scientific), lisados de VLP sedimentados o purificados y se incubaron. durante 30 min a 37°C. La absorbancia a 562 nm se midió usando un espectrofotómetro SpectraMax 340PC.

Después de la cuantificación de proteínas, se mezclaron 0,7 µg de proteína total de VLP o 7,5 µl de sobrenadantes tratados con Denarase (a menos que se indique lo contrario) (3:1 [v:v]) con tampón de muestra XT 4X (Bio-Rad) suplementado con 200 mM. ditiotreitol (DTT), desnaturalizado por calor a 70 ° C durante 10 minutos en condiciones reductoras, seguido de separación de proteínas mediante SDS-PAGE utilizando geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris. La tinción de proteínas totales (azul de Coomassie) se realizó utilizando métodos estándar. La concentración de proteína VLP S se determinó mediante la comparación con un material de referencia SMT1-120 estándar de trímero S soluble (STD) de NRC Metrology utilizando un sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad) y el software Image Lab 6.1.

Para la inmunotransferencia, las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando un aparato Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) con la configuración predeterminada. Las membranas se bloquearon durante 30 minutos con leche al 5% en DPBS con Tween 20 al 0,1% (DPBS-T) seguido de tres lavados de 5 minutos con DPBS-T. Luego, las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anti-S (S1) (ProSci #9083), anti-membrana (ProSci #3529) o un anti-ERVLP-Gag p30 de ratón (producido internamente) a 1 : Dilución 1000. La incubación del anticuerpo primario fue seguida por tres lavados de 5 minutos con DPBS-T y una incubación durante 1 h con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante en una dilución 1/10.000 para anti-conejo de cabra (Jackson 111-035-003) y 1/5000. dilución para anti-ratón de cabra (Sigma A2304). Después de tres lavados adicionales de 5 minutos con DPBS-T, las bandas se visualizaron con el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad) y el sistema de imágenes ChemiDoc MP. Todas las imágenes de gel/blot sin recortar se pueden consultar en la figura complementaria 5.

El método ELISA para detectar la unión de S-VLP a hACE2 se proporciona en la sección Métodos complementarios.

La cuantificación de CHO HCP se determinó mediante ELISA utilizando el kit CHO Cygnus (Cat # F550-1) según el protocolo del fabricante.

La observación de las VLP mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM, HITACHI H-7500 y HITACHI HT7700 120), equipado con una cámara AMT NanoSprint de 12 MP montada en la parte inferior y que funciona a 80 kV en modo de alto contraste, se realizó mediante tinción negativa. Las rejillas TEM (malla Cu 200, soporte de carbono de 15 a 25 nm) se descargaron recientemente utilizando EMS GloQube-D, un sistema de descarga luminosa de doble cámara (Electron Microscopy Sciences) en modo negativo con una corriente de plasma de 25 mA durante 45 s. Dichas rejillas se hicieron flotar en alícuotas de muestra de 10 µl en Parafilm durante 5 minutos. Posteriormente, el exceso de gotas se eliminó del borde de la rejilla con tiras de papel de filtro (Whatman 541). Luego se enjuagó la rejilla tres veces con tres gotas de agua bidestilada eliminando cada vez el exceso. Inmediatamente después del último enjuague, la rejilla se expuso a la solución de tinción (formato de uranilo al 1%) durante 60 segundos y la mancha se eliminó cuidadosamente utilizando un trozo nuevo de papel de filtro. Finalmente, la rejilla se secó a temperatura ambiente durante 2 h y se utilizó para el análisis TEM.

Las muestras de S-VLP se prepararon mediante crio-plunge21 con un émbolo Leica-EM GP2. Las rejillas TEM (malla Cu 400, con película de carbono perforada) se trataron con un limpiador de plasma Harrick PDC-32G con una potencia de plasma de 18 W durante 60 s. Dichas rejillas se recogieron con unas pinzas con adaptador y se cargaron en una cámara ambiental (humedad ~80%) de la unidad Leica-EM GP2. Se aplicaron 5 µl de la muestra acuosa en el lado de la película de carbón de la rejilla TEM y se secaron con un papel de filtro (Whatman #1) durante 1,5 s. Luego, la rejilla se sumergió en etano líquido con una temperatura de -180 °C y se transfirió a una caja de criomuestras en nitrógeno líquido (LN2). La caja de muestra se transfirió aún más en LN2 y se cargó en un soporte crio-muestra Gatan 914 preenfriado (-180 ° C) en una estación de trabajo llena de LN2. En la columna TEM se insertó el soporte con la crio-rejilla protegida bajo una cubierta anticongelante. La observación de la muestra de VLP crio-sumergidas se llevó a cabo en un TEM JEOL 2200 FS, que funciona a 200 kV, equipado con un filamento de emisión de campo. Las colecciones de imágenes se realizaron en modo de dosis baja22 para mitigar el daño del haz. Se utilizó un filtro de energía de 10 eV de ancho (con solo electrones de pérdida de energía cero que contribuyen a la formación de la imagen) para mejorar el contraste de la imagen. Cada imagen se recopiló con un tiempo de exposición de entre 0,5 y 1 s según el espesor del hielo vítreo local y la configuración del microscopio. Las imágenes se procesaron con las funciones integradas (suave, inversión de contraste) del software Gatan DigitalMicrograph.

La cuantificación de la proteína S en la superficie de VLP y el método de modelado se describen en la sección Métodos complementarios.

NTA analizó el material purificado de S-VLP y las muestras simuladas contenidas en DPBS con un NanoSight NS 5000 (Malvern Panalytical) equipado con una longitud de onda láser de 532 nm y un filtro de paso largo de 565 nm. Se adquirieron dos conjuntos de datos. Los parámetros para las mediciones de NTA de las muestras se realizaron de la siguiente manera: las VLP y las perlas de poliestireno se capturaron 3 veces (1 preparación independiente) a una temperatura de 20 °C con el nivel de la cámara en 16 (Slider Shutter 1300; Slider Gain 512). Se utilizaron las siguientes configuraciones de análisis para procesar los datos adquiridos; Umbral de detección 3; El tamaño de desenfoque y la distancia máxima de salto eran automáticos. Las muestras de VLP se diluyeron en DPBS a un volumen final mínimo de 1 ml para permitir la inyección replicada. La aspiración de la muestra al sistema se realizó utilizando la bomba peristáltica integrada conectada al tubo. Se preparó un volumen mínimo de 1,8 ml para cada muestra para permitir un análisis técnico replicado. La calibración de NanoSight NS 5000 se llevó a cabo cargando perlas de poliestireno de 100 nm, 1/100.000 (Thermo Fisher Scientific) con un criterio de aceptación predeterminado de 15 a 90 partículas por cuadro y un ≤15% de CV entre inyecciones de la misma preparación.

Las muestras simuladas se diluyeron en DPBS a 1:475. Las S-VLP se diluyeron a 1:500, 1:1000, 1:1250, 1:1500 y 1:2000. El procesamiento de imágenes, la distribución del tamaño de partículas y los cálculos de concentración se realizaron con el software analítico NanoSight NTA 3.2 (Malvern Panalytical) con un modelo de ajuste de longitud de pista finita (FTLA).

El método de análisis de glicosilación de proteína S para S-VLP o proteína S se describe en detalle en la sección Métodos complementarios.

Se compraron ratones hembra C57BL / 6 (de 6 a 8 semanas de edad) y hámsteres dorados sirios (81 a 90 g) de Charles River Laboratories (Saint-Constant, Canadá). Los animales se mantuvieron en las instalaciones para animales del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (NRC) de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Todos los procedimientos realizados en animales en este estudio fueron aprobados por nuestra Junta de Revisión Institucional (Comité de Cuidado de Animales de Terapéutica de Salud Humana del NRC) y cubiertos por el protocolo de uso de animales 2020.06 y 2020.10. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE. Los hallazgos del presente manuscrito no se aplican a ningún sexo en particular, pero se prefirieron las hembras de roedores porque tienden a ser menos agresivas durante la manipulación y socializan mejor entre ellas.

Se inmunizaron ocho grupos (n = 10 por grupo) de ratones y cuatro grupos (n = 6 por grupo) de hámsters con diferentes formulaciones para evaluar la inmunogenicidad de las S-VLP. En resumen, las S-VLP purificadas por afinidad y los componentes adyuvantes de la vacuna se mezclaron y diluyeron en PBS (Thermo Fisher Scientific) antes de la administración en un volumen final de 50 µl por dosis. Los niveles de dosis de Adju-phos (Invivogen) se basaron en datos de estudios previos con 50 µg de Al3+ incluidos por dosis23. Se utilizó AS01b (GlaxoSmithKline, Brentford, Reino Unido) basado en la saponina QS-21 y el agonista de TLR4 monofosforil lípido A (MPL) a 1/20 de la dosis humana.

Los animales se inmunizaron mediante inyección intramuscular (im) (50 µl) en el músculo tibial anterior (TA) izquierdo los días 0 y 21. Se formularon formulaciones de vacuna de 3 µg de S-VLP solas, o 3, 0,3 y 0,06 µg de S con adyuvante. -Se administraron VLP a ratones. Las formulaciones de vacunas para estudios con hámster consistieron en: vehículo PBS (sin tratamiento previo), 0,3 µg de S-VLP, AS01b solo y 0,3 µg de S-VLP+AS01b. Las cantidades de S-VLP se basan en la cantidad de proteína S presente en las partículas purificadas y las cantidades de adyuvante se mantuvieron constantes independientemente de la dosis de antígeno. El día 28, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y luego sacrificados mediante dislocación cervical antes de la recolección de bazos para medir las respuestas inmunes celulares mediante IFN-γ ELISpot. Los ratones se sangraron a través de la vena submandibular los días 20 y 28 y se utilizó suero recuperado para la cuantificación de los niveles de anticuerpos IgG específicos del antígeno y los ensayos de neutralización. El día 35, los hámsteres fueron expuestos por vía intranasal a 1 × 105 UFP de la cepa ancestral del SARS-CoV-2 (Canada/ON/VIDO-01/2020, obtenida del Laboratorio Nacional de Microbiología, Winnipeg, Canadá) y se monitoreó el cambio de peso corporal durante el los próximos cinco días consecutivos. El día 40, los animales fueron sacrificados mediante exposición a CO2 (después de anestesia con isofurano) y se recogieron tejidos pulmonares para evaluar la carga viral mediante ensayo de placa y detección y cuantificación de ARN viral mediante RT-qPCR.

El método para determinar las IgG anti-S totales ha sido descrito previamente23 y puede consultarse detalladamente en el apartado de Métodos complementarios.

El ensayo de neutralización sustituta se realizó como en la ref. 24 y se describe en la sección Métodos complementarios.

Se aisló ARN viral (ARNv) a partir de tejido pulmonar homogeneizado en 1 ml de RNA/DNA Shield (Zymo Research). El ARNv se extrajo en condiciones BSL-3 con el kit viral Quick-RNA (Zymo Research). El ARN genómico viral se cuantificó mediante PCR en tiempo real para el gen de la envoltura viral diana como se describió anteriormente25.

Este ensayo se llevó a cabo en instalaciones de nivel de contención 3 (CL3) como se describió anteriormente23. Brevemente, todos los pulmones izquierdos de cada hámster se homogeneizaron individualmente en 1 ml de PBS y se centrifugaron. Luego, los sobrenadantes clarificados se diluyeron 1 en 10 diluciones en serie en medios de infección (1 × DMEM, medios con alto contenido de glucosa suplementados con 1 × aminoácidos no esenciales, penicilina-estreptomicina 100 U/mL, piruvato de sodio 1 mM y suero bovino al 0,1%). albúmina). A continuación, se infectaron células Vero E6 durante 1 h a 37 °C antes de retirar el inóculo y agregar el medio de superposición, que consistía en medio de infección con agarosa ultrapura al 0,6% de bajo punto de fusión. Las células infectadas se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 72 h. Después del tiempo de incubación, las células se fijaron con formaldehído al 10% y se tiñeron con cristal violeta. Se enumeraron las placas y se determinaron las UFP por gramo de tejido pulmonar.

Todos los gráficos y análisis estadísticos de las figuras presentadas en este manuscrito se realizaron con GraphPad Prism 9.3.1 (software GraphPad). Se evaluaron ocho grupos (n = 10 por grupo) de ratones y cuatro grupos (n = 6 por grupo) de hámsteres para experimentos in vivo. Se realizó un ANOVA unidireccional con pruebas de comparación múltiple de Tukey para evaluar la importancia de la IgG anti-S total y la cuantificación de los análisis de células T específicas de picos. Se realizó un ANOVA unidireccional con pruebas de comparación múltiple de Dunnette para evaluar la importancia de los ensayos de neutralización sustituta basados en células, la cuantificación del virus mediante ensayo de placa y la cuantificación del ARN viral en pulmones de hámster. Se consideró estadísticamente significativo p ≤ 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Dadas las ventajas y el uso generalizado de las células CHO para la fabricación de proteínas terapéuticas, inicialmente exploramos su potencial para producir VLP mediante la cotransfección de las proteínas estructurales S, M y E del SARS-CoV-2 (Figura complementaria 1a). Se ha informado que estos son los componentes virales mínimos que permiten la formación de VLP cuando se coexpresan27,28. 5 días después de la transfección, observamos la presencia de proteínas M y S en partículas sedimentables de sobrenadantes celulares mediante SDS-PAGE (tinción de proteínas totales y transferencia Western, Fig. 1a). Sin embargo, las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) con tinción negativa detectaron pocas partículas envueltas y las que se observaron no albergaban una corona bien definida, una característica de los coronavirus, ya que la densidad de las proteínas S que sobresalían era bastante baja (Fig. 1b). .

a Sobrenadantes sedimentados con un cojín de iodixanol al 15% de células CHO2353 transfectadas con plásmidos S o ME/S. A la izquierda, tinción de proteínas totales (azul de Coomassie) de S o ME/S. A la derecha, inmunotransferencia con anti-Spike (S1) que detecta S (~180 kDa). La proteína de membrana (M) del SARS-CoV-2 se detecta con anti-M a ~17 kDa. b Imagen TEM representativa de VLP ME/S sedimentadas. Las flechas blancas indican VLP potenciales. En la parte inferior de la imagen se muestra una barra de escala de 100 nm. c Imagen TEM representativa de VLP sedimentadas generadas por la expresión de la proteína S (S-VLP). En la parte inferior de la imagen se muestra una barra de escala de 200 nm. Las flechas blancas indican VLP. d Inmunotransferencia representativa de diferentes variantes de S-VLP detectadas con anti-S1. De izquierda a derecha, S-VLP simuladas, beta (B.1.351), delta (B.1.617.2) y omicron (B.1.1.529). e Imágenes TEM representativas de variantes de S-VLP sedimentadas. De izquierda a derecha, beta (B.1.351), delta (B.1.617.2) y omicron (B.1.1.529). En la parte inferior de cada imagen se muestra una barra de escala de 50 nm.

Sorprendentemente, cuando S se expresó sola, se detectaron niveles sustancialmente más altos de esta proteína en los sobrenadantes de células CHO a pesar de la presencia de un dominio transmembrana intacto que debería impedir su secreción como proteína soluble. La proteína S también podría sedimentarse mediante ultracentrifugación sobre un cojín de yodixanol (Fig. 1a), lo que sugiere que la S sola desencadenó la formación de VLP. Sorprendentemente, observamos mediante TEM la presencia de una gran cantidad de VLP generalmente esféricas rodeadas por una corona bien definida formada por una densa capa de proteína S (Fig. 1c). La capacidad de formar VLP utilizando este enfoque no se limitó a la secuencia S ancestral: la transfección de células CHO con construcciones de plásmidos de expresión que codifican proteínas S de variantes Beta, Delta y Omicron también generó VLP. Tras la expresión de estas construcciones, detectamos la presencia de proteínas S en muestras sedimentadas con iodixanol mediante transferencia Western (Fig. 1d) y confirmamos la formación de VLP de diferentes variantes S del SARS-CoV-2 mediante TEM (Fig. 1e). Este último demuestra que este enfoque se puede aplicar a diferentes secuencias de variantes S. Los experimentos restantes, incluida la purificación, caracterización y pruebas in vivo, se realizaron utilizando VLP que mostraban S de la cepa ancestral. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe la producción de VLP del SARS-CoV-2 a partir de células de mamíferos mediante la sobreexpresión de la proteína S nativa sin ningún otro componente viral.

La liberación de ERVLP por las células CHO29,30 podría ser una preocupación para la fabricación de vacunas VLP recombinantes envueltas, en particular, debido a la probable similitud estructural y biofísica de las VLP envueltas recombinantes y las ERVLP CHO endógenas que harían que la separación de las dos entidades fuera un desafío durante el proceso de desarrollo. pasos de procesamiento. CRISPR-Cas9 se ha utilizado para atacar elementos provirales similares a retrovirus como gag y env en el genoma de CHO18, y utilizamos este enfoque de manera similar para diseñar una línea celular CHO, CHO-C2, con producción interrumpida de ERVLP. Como se muestra en la Fig. 2a, CHO-C2 proporciona rendimientos de S-VLP similares a los de las células no modificadas genéticamente pero sin la presencia de ERVLP, como lo indica la transferencia Western de Gag (Gag es el principal componente proteico responsable de la formación y gemación de estas partículas) 18. La productividad volumétrica de las S-VLP producidas en células CHO-C2 (cosechadas 5 días después de la transfección) promedió 8,5 ± 0,4 mg/L (error estándar de la media [SEM]; n = 6), según el contenido de proteína S del iodixanol. -partículas sedimentadas (Fig. 2b). En la literatura, al describir otros métodos para producir VLP que muestran SARS-CoV-2 S, rara vez se muestran títulos volumétricos de proteína S en sobrenadantes no purificados. En un informe, se estimó que el sobrenadante de VLP basado en Gag de células HEK293 contenía 1,78 mg/l de proteína S31. Es de destacar que el proceso de purificación posterior para las VLP de Gag-S puede reducir drásticamente las concentraciones de S31.

Células CHO-C2 (ERVLP-KO). A la izquierda, tinción de proteína total (azul de Coomassie) que muestra VLP sobrenadantes (7,5 µl) y sedimentadas (0,35 µg de proteína total) producidas en CHO2353 (parental) o CHO-C2. A la derecha, transferencia Western de VLP producidas por CHO2353 o CHO-C2. La parte superior de la transferencia muestra la proteína S de longitud completa detectada por anti-Spike (S1) en VLP clarificadas o sedimentadas. La transferencia inferior está teñida con anti-Gag p30 y muestra la ausencia de Gag en las VLP derivadas de CHO-C2. b Gráfico de dispersión de proteína S total (mg/L) de diferentes muestras a los 5 días de la transfección. Los datos se presentan como media ± SEM de seis muestras independientes. c Comparación de la tinción de proteína total de S-VLP sedimentadas y purificadas por afinidad. A la izquierda, se cargó 1 µg de proteína S soluble recombinante (S STD). Para las VLP, se cargaron 0,7 µg de proteína total por pocillo. d Imagen TEM representativa de S-VLP purificadas por afinidad. En la parte inferior se muestra una barra de escala de 200 nm. e Imagen TEM representativa de alta resolución de S-VLP individuales purificadas por afinidad adquiridas con un HITACHI HT7700 120. En la parte inferior se muestra una barra de escala de 50 nm. f Diagrama de dispersión de proteína S total (mg/L) de diferentes muestras purificadas a los 5 días de la transfección. Los datos se presentan como media ± SEM de cuatro muestras independientes. g ensayo ELISA. Curva dosis-respuesta de S-VLP purificada (concentración inicial [S] = 0,081 mg/ml) que muestra 11 diluciones en serie. Los puntos rojos representan S-VLP en una placa recubierta con hACE2 en una curva sigmoidea en forma de S en rojo. Los puntos azules representan S-VLP en una placa sin recubrimiento (simulada) conectada por una línea azul.

En general, resulta difícil desarrollar esquemas de purificación para separar las VLP recombinantes envueltas de las ERVLP y otras vesículas extracelulares liberadas espontáneamente de las células huésped. Para la purificación de S-VLP, probamos varias resinas de cromatografía en columna convencionales con resultados insatisfactorios antes de proceder a evaluar las opciones de cromatografía de afinidad, incluidas resinas de afinidad S comerciales (p. ej., Repligen o Avitide) y preparaciones internas de perlas conjugadas con anticuerpos S o recombinantes. ACE2 humana (hACE2). Todas las resinas probadas se unieron eficazmente a las VLP, pero su elución en condiciones no desnaturalizantes fue bastante ineficiente. Para abordar este problema, Avitide (AVIPure COV2S VLP) generó una resina de afinidad S con menor densidad de ligando. Esta resina permite una captura eficaz y una elución suave de S-VLP, que luego podrían intercambiarse con tampón y esterilizarse mediante filtración de 0,2 µm para pruebas in vivo. En comparación con las muestras sedimentadas con iodixanol, las S-VLP purificadas por afinidad contienen niveles visiblemente más bajos de proteínas no S mediante tinción de proteína total y muestran una alta concentración de partículas con morfología preservada por TEM (Fig. 2c-e). Para evaluar si la proteína S en la superficie de las VLP es capaz de unirse a su receptor hACE2 mediante la exposición del dominio de unión al receptor (RBD), realizamos un ensayo ELISA tipo sándwich basado en la captura de VLP por hACE2 recombinante seguido de la detección con anti -anticuerpos de pico. Como se muestra en la Fig. 2g, las S-VLP se unen a las placas recubiertas con hACE2 pero no a las placas de control no recubiertas.

Utilizando un kit ELISA de proteína de la célula huésped (HCP) CHO como ensayo ortogonal para evaluar la pureza, determinamos que las preparaciones de VLP purificadas por afinidad en un solo paso contienen aproximadamente 47 × 103 ppm de HCP (en relación con la proteína total) (Tabla 1). Para una dosis clínica prospectiva de 3,75 µg de proteína S (basada en la vacuna Covifenz SARS-CoV-2 VLP10), esto correspondería a 0,17 µg de HCP en S-VLP. En comparación, se ha informado que la vacuna ChAdOx1 nCov19 (AstraZeneca) contiene sustancialmente más HCP por dosis32. Nuestro método de producción basado en CHO-C2 seguido de una purificación por afinidad en un solo paso produjo 2,4 ± 0,3 mg/l (SEM) de VLP según el contenido de proteína S (Fig. 2g). En particular, otras plataformas de VLP que dependen de la coexpresión de Gag con S para impulsar la formación de VLP dan proporciones purificadas de S a Gag que son muy bajas (p. ej., VLP purificadas descritas por VBI que contienen como máximo un 2,78 % de proteína S en relación con Gag9). con niveles totales de proteína S mucho más bajos (0,015 mg de S en VLP purificadas a partir de un litro de sobrenadante de HEK2939,31). En tales casos, Gag es, con diferencia, la proteína más abundante en el producto VLP purificado final (en comparación con las S-VLP que están compuestas de >80 % de proteína S); Aunque en varios estudios se ha demostrado que las VLP basadas en Gag-S son inmunógenos eficaces, creemos que la mayor densidad de S y los niveles reducidos de proteínas estructurales no relevantes son una ventaja probable de nuestra plataforma VLP.

También establecimos la cantidad y el tamaño de las VLP mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y evaluamos la estabilidad durante el almacenamiento a 4 °C. Las S-VLP purificadas a partir de un cultivo de 1 litro contenían 1,38 × 1013 partículas con un ancho medio de 119 a 128 nm. En comparación, las VLP del SARS-CoV-2 purificadas generadas en células de insecto mediante la expresión de VLP M + E + S o Gag-S de células HEK293 produjeron hasta 5,8 × 1011 y 6,03 × 1010 partículas por 1 litro de cultivo, respectivamente31,33. . Es de destacar que las concentraciones de partículas de S-VLP permanecieron constantes durante el almacenamiento durante al menos 100 días a 4 °C, lo que indica una muy buena estabilidad en almacenamiento (Tabla 2, Figura complementaria 2).

La inmunización mediante inyección intramuscular (im) favorece el rápido reconocimiento y absorción de los antígenos de la vacuna por parte de las APC periféricas34. En este sentido, la densidad del antígeno en la superficie del patógeno o partícula junto con su patrón de glicosilación pueden afectar la inmunogenicidad y, por tanto, la respuesta inmune resultante5,35. Las imágenes TEM con tinción negativa indican que las S-VLP contienen más S en su superficie (Fig. 2e) que los viriones del SARS-CoV-2 producidos en células Vero E636,37. Para investigar esto más a fondo, visualizamos partículas mediante Cryo-EM. Los trímeros de proteína S periférica en las VLP recuerdan la configuración de prefusión con longitudes promedio de ~ 20 nm (Fig. 3a), similares a las informadas en estudios anteriores37. La alta resolución de las imágenes Cryo-EM nos permitió contar trímeros de proteína S circunferenciales en una gran cantidad de VLP con diámetros centrales entre 40 y 70 nm y establecer una función correlativa que relaciona el número S con el diámetro central de VLP (Figura complementaria 3a). Con una fuerte correlación de relación número/diámetro entre partículas (R2 = 0,92), calculamos la distancia euclidiana real que generó puntos equidistantes entre picos (Fig. 3b). Esto permitió modelar S-VLP tridimensionalmente usando MATLAB para estimar el número total de picos para una VLP de un tamaño determinado (por ejemplo, una VLP de 70 nm de diámetro contiene 86 picos) como se muestra en la Fig. 3c. Con base en este modelo, podemos confirmar que, en general, las S-VLP producidas con CHO contienen un contenido de S mayor que el promedio informado para los viriones intactos del SARS-CoV-2 (25 ± 12 picos)36,37.

Cryo-EM adquirió una imagen S-VLP individual (contraste positivo). La VLP representada contiene 20 proteínas S periféricas. Las proteínas S individuales son evidentes en la imagen ampliada, sobresaliendo de la envoltura con un tamaño promedio de 20 nm. En la parte inferior de cada imagen se muestra una barra de escala de 25 nm. b Esquema del flujo de trabajo de cálculo desde la longitud del arco medida entre dos picos periféricos hasta la distancia euclidiana real entre picos en la superficie del núcleo de VLP. c Reconstrucción de la distribución de S en VLP utilizando la distancia euclidiana real. Los modelos VLP corresponden a diámetros de núcleo de 40 nm/35 picos, 50 nm/50 picos, 60 nm/67 picos y 70 nm/86 picos. d Identificación de composición de glucanos de las proteínas S-VLP y recombinantes solubles (SmT2v3). La identidad y proporción de 20/22 N-glicanos se determinaron mediante LC-MS y se presentaron en gráficos circulares. Consulte también la figura complementaria 3 y el archivo de datos complementarios.

La capacidad de las células CHO para proporcionar glicoproteínas con glicosilación similar a la humana podría ser ventajosa para los candidatos a antígenos vacunales en comparación con los producidos en células hospedadoras no mamíferas (por ejemplo, plantas, levaduras o células de insectos)38. La composición de los glucanos podría no necesariamente afectar la estructura de la proteína S o la unión al receptor, pero podría cambiar drásticamente su estabilidad térmica o su potencia para generar anticuerpos neutralizantes39. Es importante destacar que las proteínas S no estabilizadas (similares a las expresadas por ChAdOx1 nCoV19) han mostrado patrones de glicosilación diferentes en comparación con las S y S triméricas recombinantes estabilizadas de los viriones del SARS-CoV-2, todos derivados de células humanas, lo que también podría influir en la antigenicidad y otros propiedades biológicas40.

Para investigar posibles discrepancias en la glicosilación entre el ectodominio S soluble producido por CHO y la S-VLP, realizamos ensayos LC-HCD MS/MS y perfilamos los glicanos presentes en 20 de 22 posibles sitios de N-glicosilación de la proteína S presente en las S-VLP. o producido como un trímero de ectodominio recombinante soluble (SmT2v3), también a partir de células CHO. Para ambos tipos de muestras, los sitios de N-glicosilación estaban en su mayoría sialilados y fucosilados en el núcleo con glicanos de tipo complejo que tendían a ser biantenarios o triantenarios. Comúnmente se observaron niveles altos de manosa en sitios específicos y también se observaron niveles bajos de glicanos híbridos en algunos otros sitios (Fig. 3d y Fig. Suplementaria 3b). Se detectó una diferencia importante entre soluble y VLP-S en N1194. El sitio de glicosilación N1194 en la VLP-S se glicosiló con supuestas repeticiones de N-acetilactosamina (LacNAc) que no se detectaron en SmT2v3, en el que este sitio estaba mayoritariamente desocupado (Fig. 3d). Hasta donde sabemos, no existe ninguna función biológica reportada asociada con la presencia o ausencia de un glicano en N1194. En general, nuestros análisis revelaron que la glicosilación de la proteína S soluble y asociada a VLP es bastante similar (Fig. 3d y Fig. complementaria 3b) y es comparable a la encontrada en la proteína S soluble producida por las células HEK293F, así como por el SARS-CoV- 2 S asociados a viriones producidos por células Vero36,41,42.

Por el contrario, la glicosilación de S puede diferir notablemente para las proteínas y VLP producidas en otros huéspedes de producción utilizados para la fabricación de vacunas. Las plantas de Nicotiana benthamiana utilizadas para la producción de VLP por Medicago generan S con glicanos conocidos como supuestos alérgenos vegetales43,44,45. Además, las células de insectos como Sf9, que se utilizan para fabricar vacunas basadas en Novavax y Sanofi S, producen glicoproteínas con glicanos principalmente altos en manosa, oligomanosa y paucimanosa (este último también puede contener un residuo de fucosa central unido a α1,3 inmunogénico). )45,46,47,48. Serán necesarios más estudios para dilucidar el impacto de estas estructuras de glucanos en la inmunogenicidad de la proteína S. El procesamiento de APC y la presentación a las células B de una proteína S que contiene glicanos inmunogénicos o glicanos que normalmente no se encuentran en los viriones del SARS-CoV-2 pueden desviar la respuesta inmune hacia epítopos que no protegen contra el virus natural.

En conjunto, estos resultados demuestran que las S-VLP producidas por CHO muestran una mayor densidad de proteínas S en su superficie que el virus nativo producido en células Vero con glicosilación similar a la reportada previamente para S producida por células humanas y Vero (como ectodominio soluble). o asociado con partículas de virus).

Se evaluó el potencial de las S-VLP como antígenos vacunales, solos o en combinación con adyuvantes, en modelos in vivo de ratón y hámster. Los ratones se inmunizaron primero el día 0 y luego se reforzaron el día 21 con VLP solas (que contienen 3 µg de proteína S), o en diferentes dosis (3, 0,3 o 0,06 µg de proteína S) con adyuvantes Adju-phos o AS01b. El análisis de las muestras de suero del día 28 demostró que las VLP inducían anticuerpos anti-S incluso sin adyuvante, pero tan solo 60 ng de VLP inducían títulos >4 veces mayores que el antígeno solo cuando se adyuvaban con Adju-phos y >23 veces mayores con AS01b (Figura 4a). IFN-γ ELISpot demostró que las VLP + AS01b provocan fuertemente respuestas específicas de células T en todas las dosis probadas, moderadamente con el antígeno solo pero inhibidas cuando se combinan con Adju-phos (Fig. 4b). Un ensayo de neutralización sustituto que utiliza proteína S de cepa ancestral demostró una variabilidad sustancial en la actividad de neutralización con suero de los grupos VLP y VLP + Adju-phos (Fig. 4c). Por el contrario, el suero del grupo VLP+AS01b alcanzó la máxima actividad neutralizante contra la cepa de referencia S, dada la dilución utilizada en nuestro protocolo. Las variantes de las proteínas Beta, Delta y Omicron BA.4-5S también fueron neutralizadas eficazmente por el suero de ratones inmunizados con VLP + AS01b incluso con la dosis más baja de 60 ng probada (Figura complementaria 4). Con base en estos resultados, llegamos a la conclusión de que las VLP + AS01b provocan una fuerte respuesta inmune humoral y celular contra las cepas de virus ancestrales y diferentes en ratones. Por el contrario, las VLP y VLP+Adju-phos desencadenaron IgG específicas pero tendieron a ser menos inmunogénicas junto con una actividad neutralizante nula o menos potente. Es importante destacar que VLP + Adju-phos parece afectar la respuesta celular (Fig. 4b). Por lo tanto, decidimos no realizar más pruebas de este adyuvante.

a* Títulos de respuesta inmune humoral (IgG anti-spike total) en ratones vacunados con diferentes formulaciones de S-VLP. Los títulos medios geométricos (GMT) de Anti-S el día 28 de los grupos sin tratamiento previo y tratados se determinaron mediante ELISA. b* Cuantificación de células T específicas de picos. Se incubaron conjuntamente esplenocitos aislados de ratones vacunados con formulaciones de S-VLP con una biblioteca de péptidos de pico. La cuantificación de las células secretoras de IFN-γ+ se realizó mediante ELISpot y los resultados se expresaron como la media de esplenocitos de IFN-γ+/106. c** Ensayo de neutralización sustituta basado en células (hACE2-HEK293T). El porcentaje medio de neutralización para el SARS-CoV-2 se determinó a partir de diluciones de 1:25 en condiciones sin adyuvante y Adju-phos o de 1:75 en condiciones AS01b. a – c Los datos se presentan como media geométrica ± SEM (10 ratones por grupo). Los puntos negros representan animales ingenuos, azules para los que no reciben adyuvante, rojos para Adju-phos y verdes para AS01b S-VLP. d Cambio de peso corporal en hámsteres inmunizados infectados con SARS-CoV-2 (cepa ancestral). El gráfico de líneas representa las mediciones diarias del peso corporal de animales vacunados y no expuestos después de la exposición. e** Cuantificación de virus mediante ensayo de placa. Las unidades formadoras de placa (UFP) se cuantificaron en células Vero E6 infectadas con homogeneizados de pulmón de hámster. La carga viral (log10) se muestra en UFP por gramo de pulmón. f** Cuantificación de ARN viral en pulmones de hámster. Las muestras de ARN de animales vacunados y no expuestos cinco días después de la exposición se sometieron a detección de ARN viral mediante RT-qPCR. La concentración de ARN del SARS-CoV-2 se muestra en copias de ARNg/pulmón (log10). d – f Los datos se presentan como media ± SEM (6 animales por grupo). Los puntos negros (barras grises) representan animales ingenuos, el azul son S-VLP sin adyuvante, el naranja AS01b y el verde representa S-VLP+AS01b. *Se realizó un ANOVA unidireccional con pruebas de comparación múltiple de Tukey o **Dunnette para evaluar la significancia. p ≤ 0,0001, p ≤ 0,001, p ≤ 0,01 y p ≤ 0,05 están representados por cuatro, tres, dos y un asteriscos, respectivamente, y p > 0,05 como no significativo (NS).

A continuación, evaluamos la protección proporcionada por la inmunización con formulaciones de S-VLP en un modelo de exposición a hámster. Después de dos dosis de vacuna seguidas de infección por SARS-CoV-2, se observó una marcada reducción en la pérdida de peso para el grupo de VLP + AS01b en comparación con los grupos de control no vacunados y de VLP sin adyuvante (Fig. 4d). En consecuencia, un ensayo de placa homogeneizada de pulmón mostró una carga viral de SARS-CoV-2 drásticamente reducida en el grupo de VLP + AS01b y una reducción menor pero notable en los animales que recibieron VLP sin adyuvante (p = 0,0003) (Fig. 4e). Las diferencias en los niveles de ARN viral fueron menos pronunciadas, con una diferencia notable solo en el grupo de VLP + AS01b (p = 0,015) (Fig. 4f), probablemente debido a diferencias en la cinética de eliminación/eliminación del ARN y del virus, como se informó en cohortes vacunadas y no vacunadas49 . Así, in vivo, los modelos confirmaron que las S-VLP+AS01b provocaron una fuerte respuesta Th1/Th2 y protegieron completamente a los animales contra la infección por SARS-CoV-2, incluso a niveles de dosis bajos en nanogramos.

En conjunto, estos resultados sugieren que las S-VLP + AS01b podrían ser más inmunogénicas que la mayoría de las vacunas VLP actualmente en fases preclínicas o clínicas. VBI-2902a utilizó dosis de 0,2 y 1 µg de proteína S con adyuvante de VLP basadas en Gag-S para inducir anticuerpos neutralizantes y otorgar protección en modelos murinos, respectivamente9. Las VLP generadas por el ensamblaje de 4 proteínas estructurales (SMEN) del SARS-CoV-2 necesitan 2,83 μg de antígeno con adyuvante para producir anticuerpos neutralizantes (EC50) en ratones4. ABNCoV2 que utiliza tecnología Tag/Catcher de proteína dividida, donde el S RBD producido en células de insectos está vinculado a una partícula similar a la cápside del bacteriófago AP205 producida en E. coli, induce actividad neutralizante en ensayos preclínicos y clínicos utilizando 6,5 o ≥ 6 µg de antígeno con adyuvante. , respectivamente50,51. Además, la dosis eficaz de la vacuna en humanos de Medicago-Covifenz requirió una dosis inicial de 3,75 µg y una dosis de refuerzo similar de VLP-S10. Sorprendentemente, nuestro estudio indica que en modelos de ratón y hámster, las S-VLP requieren una dosis tan baja como de 0,06 a 0,3 µg de proteína S cuando se les añade AS01b para inducir una potente actividad neutralizante junto con una protección concomitante contra la exposición al SARS-CoV-2.

En resumen, a diferencia de trabajos publicados anteriormente que utilizan otras plataformas de expresión basadas en células4,9,10,27,50,51,52, hemos descubierto que la expresión de SARS-CoV-2 S sola en células CHO es suficiente para inducir el ensamblaje. y liberación de abundantes VLP recubiertas de S de alta densidad. En comparación con las tecnologías VLP alternativas, las S-VLP no solo muestran una potencia in vivo similar o mejor, sino que también permiten procesos de producción y purificación posteriores simplificados, lo que debería facilitar la fabricación a gran escala y de bajo costo. Esperamos que las S-VLP producidas por CHO puedan proporcionar una plataforma de vacuna ágil y rentable para continuar combatiendo la pandemia actual, incluidas las futuras variantes preocupantes del SARS-CoV-2.

Las secuencias codificantes de VLP de M, E y S utilizadas en este trabajo están disponibles a través de GenBank (Secuencia de referencia NCBI: NC_045512.2). Las mutaciones en la secuencia de la proteína S para la generación de S-VLP se describen detalladamente en la sección "Métodos". La información complementaria contiene los siguientes detalles. Fig. 1 complementaria: Generación de diferentes tipos de S-VLP. Fig. 2 complementaria: Cuantificación y determinación del tamaño de S-VLP por NTA. Fig. complementaria 3: Estimación de la densidad de la proteína S en la superficie de la partícula y análisis de glicosilación S. Fig. complementaria 4: Ensayo de neutralización sustituta basado en células (Vero E6) para variantes del SARS-CoV-2. Fig. complementaria 5: Imágenes digitales sin recortar de geles y transferencias. Además, el archivo de información complementaria contiene métodos adicionales utilizados en el presente manuscrito. Los datos generados para los estudios de glicosilación se proporcionan en el Archivo de datos complementario 1. Los datos numéricos subyacentes a las Figs. 2b, f, g, 3b y 4 se pueden encontrar en el Archivo de datos complementarios 2. Todos los demás datos estarán disponibles previa solicitud razonable al autor correspondiente.

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Agradecemos al Dr. Warren Kett de Avitide Inc. por proporcionar la resina de afinidad VLP AVIPure-COV2S. Esta es una publicación de la NRC n.º NRC-HHT_53654A.

Centro de Investigación sobre Terapéutica de Salud Humana, Consejo Nacional de Investigación de Canadá, 6100 Royalmount Avenue, Montreal, QC, H4P 2R2, Canadá

Sergio P. Alpuche-Lazcano, Matthew Stuible, Julie Blouin, Jean-Sébastien Maltais, Brian Cass, Daria Zoubchenok e Yves Durocher

Centro de Investigación sobre Terapéuticas de Salud Humana, Consejo Nacional de Investigación de Canadá, 1200 Montreal Road, Ottawa, ON, K1A 0R6, Canadá

Bassel Akache, Anh Tran, Tyler M. Renner, Renu Dudani, Diana Duque y Michael J. McCluskie

Centro de Investigación sobre Terapéuticas de Salud Humana, Consejo Nacional de Investigación de Canadá, 100 Sussex Dr, Ottawa, ON, K1A 0R6, Canadá

John Kelly, Anna Robotham, Arsalan Haqqani y Alexandra Star

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Sabahudin Hrapovic

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Kai Cui, Jae-Young Cho y Xinyu Wang

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SPA-L., MS y YD concibieron el estudio. SPA-L., J.-SM, MS, BC y JB realizaron la clonación, expresión, purificación, SDS-PAGE, Western blot y ELISA de VLP. Caracterización biofísica de VLP (NTA, EM, modelado de picos en la superficie de VLP, etc.) fue realizado por SH, SPA-L., DZJ-YC, KC y XW. Los análisis de glicosilación de Spike VLP fueron realizados por AR, AH, AS y JK. Los estudios en animales fueron realizados y analizados por BA, TMR, RD, MJM. , DD y AT El manuscrito fue escrito por SPA-L., MS y YD y revisado por SPA-L., MS, YD, BA y TMR

Correspondencia a Yves Durocher.

SPA-L., MS e YD declaran la presentación de una solicitud de patente provisional (nombre de la patente: ENVELOPED VIRUS LIKE PARTICLES COMPRISING SARS-COV-2 S PROTEIN, Número de solicitud: PCT/IB2023/057279, Estado de la solicitud: Tratado de cooperación en materia de patentes ( PCT) solicitud, región geográfica: solicitud al PCT para solicitud internacional). El presente manuscrito describe el uso de S-VLP como candidata a vacuna contra el SARS-CoV-2. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Communications Medicine agradece a Xin He, Maren Schubert, Kok Lian Ho y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Alpuche-Lazcano, SP, Stuible, M., Akache, B. et al. Evaluación preclínica de partículas fabricables similares al virus del pico SARS-CoV-2 producidas en células de ovario de hámster chino. Commun Med 3, 116 (2023). https://doi.org/10.1038/s43856-023-00340-7

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Recibido: 16 de marzo de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 23 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43856-023-00340-7

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